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IZKF-Projekt E-40

Projekttitel:

Nukleäre Translokation und Aktivierung kardialerTranskriptionsfaktoren bei myokardialer Hypertrophie

Projektleiter:

PD Dr. Ritter

Medizinische Klinik I

Prof. Dr. Engelhardt

Rudolf-Virchow-Zentrum

Laufzeit:

01.01.2007 - 31.12.2009

Abstract:

Kardiale Hypertrophie ist wesentlich für die Entstehung einer Herzinsuffizienz. Alle bislang bekannten Hypertrophie auslösenden Signalwege resultieren letztlich in der Aktivierung weniger Transkriptionsfaktoren. Die Antragssteller haben in den letzten Jahren die Regulation des Calcineurin/NF-AT und des Egr-Signalweges charakteri-siert. Die aktivierte Phosphatase Calcineurin dephosphoryliert den Transkriptions-faktor NF-AT, der dephosphoryliert in den Zellkern transloziert. Wir konnten zeigen, dass NF-AT dort nur in Kombination mit nukleärem Calcineurin die gesteigerte transkriptionelle Aktivität erreicht. NF-AT alleine zeigt diese Wirkung nicht.

Nukleär wirkende Proteine werden aus dem Cytoplasma durch sog. Carrier oder Cargo-Proteine (sog. Importine) in den Zellkern transportiert. Wir konnten zeigen, dass das Importin b1 als Cargo-Protein für Calcineurin fungiert. Die Interaktion zwischen Calcineurin und dem Importin erfolgt über eine nukleäre Lokalisations-sequenz (NLS). Durch kompetitive Hemmung dieser Interaktion durch IBP (Import Blocking Peptide), verbleibt Calcineurin cytosolisch und der Calcineurin/NF-AT - Signalweg wird nicht aktiviert. Dieses inhibitorische Peptid und das Prinzip der Calcineurin/NF-AT-Inhibition wurden vom Antragssteller bereits patentiert.

In dem vorliegenden Antrag soll die Funktion von Calcineurin im Zellkern analysiert werden. Folgende Funktionen sollen auf ihre Wirkung im Zellkern hin untersucht werden: Phosphataseaktivität, Funktion als transkriptioneller Co-Aktivator, Antagonist zum Exportprotein CRM1 (für NF-AT). Diese Versuche sollen zunächst auf Zellkulturebene (NRCMs) durchgeführt werden. Hierzu werden die Zellen mit verschiedenen Calcineurinmutanten transfiziert. Die subzelluläre Lokalisation soll über GFP- oder Flag Tags mikroskopisch bestimmt werden. Die Calcineurinaktivität soll durch einen NF-AT – Reporterassay und mit Hilfe der FRET-Technik gemessen werden. FRET erlaubt eine direkte Untersuchung der subzellulären Aktivierung in Echtzeit. Weitergehende Analysen zum Calcineurin Signalweg sollen in verschiedenen transgenen Tiermodellen erfolgen.

Links:

  • Medizinische Klinik I

  • Rudolf-Virchow-Zentrum